DETECÇÃO DOS HAPs
A avaliação da exposição humana aos HAPs pode ser efectuada por duas vias distintas:
• Determinação de HAPs em amostras biológicas como consequência da exposição.
• Determinação de HAPs em alimentos e amostras ambientais susceptíveis de ser uma via de exposição para o Homem.
ALIMENTOS E AMOSTRAS AMBIENTAIS
DETERMINAÇÃO EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS
A avaliação da exposição aos HAPs é efectuada em amostras de sangue e urina. Nestas determinações usam-se biomarcadores que se reconhecem como representativos da exposição a este grupo de compostos.
Os biomarcadores mais utilizados são:
• Aductos com ADN
• Metabolitos dos HAPs
• Aductos com Proteínas
Determinação dos Aductos com ADN
Os aductos com o ADN são determinados correntemente para avaliar a exposição aos HAPs e a monitorização faz-se em leucócitos, linfócitos e em alguns casos nos tecidos. Os seus valores estão aumentados após a exposição e é possível detectar aductos no ADN de linfócitos meses depois da exposição. A determinação da quantidade de aductos varia normalmente entre 1 a 40 aductos por 108 nucleótidos e apresentam em média valores aumentados em relação ao grupo controlo de 1,5 a 3 vezes.
Os aductos dos HAPs com o ADN podem ser detectados por:
Pós-marcação 32P - Método versátil para determinar vários tipos de dano no ADN em pequenas quantidades de ADN. Extremamente sensível com limite de detecção aproximado de 1 aducto por 109 nucleótidos. Neste método o ADN é hidrolisado, faz-se uma extracção com butanol e os nucleótidos normais são digeridos pela nuclease P1. Os nucleótidos com aductos são fosforilados com [32P]-ATP e cinase polinucleótidica, e após separação por TLC ou HPLC (que apresenta melhores resultados) é calculada a quantidade de aductos pela radiação emitida.
A principal limitação a apontar a este método é a sua baixa especificidade que impede a sua utilização em misturas mais complexas.
Espectrometria de Massa (EM) – Este método apresenta um grande potencial pois pode ser combinado com outras técnicas como a Cromatografia Gasosa (CG) oferecendo uma grande sensibilidade e especificidade. Devido aos elevados custos associados e à falta de estabilidade térmica de alguns tipos de aductos não é utilizada com muita frequência. Actualmente para ultrapassar estas limitações tenta-se combinar a EM com outras técnicas como Cromatografia Líquida/Ionização Electrospray, emprega-se a EM-“tandem” e a EM acelerada.
Imunoensaios – Conjunto de técnicas usadas na detecção e quantificação do dano no ADN por recurso a anticorpos dirigidos para a alteração provocada pelo agente carcinogénico ou mutagénico. Como o uso de anticorpos dirigidos aos aductos dos HAPs com o ADN tornou-se possível detectar directamente os estragos no ADN. Os anticorpos usados podem ser monoclonais ou policlonias apresentando os policlonais uma sensibilidade de 2 aductos por 107 nucleótidos. O desenvolvimento dos anticorpos é normalmente de dois tipos de imunogenes, ADN não hidrolisado com aductos complexado electro-estaticamente com proteína transportadora metilada ou monoaductos acoplados a proteína transportadora. Na determinação quantitativa as técnicas mais utilizadas são os Radioimuno Ensaios (RIA), a técnica de ELISA e “ immunoslot blot” (ISB) não competitivo. A principal limitação destas técnicas é a baixa sensibilidade quando comparada com os outros métodos.
PCR – A técnica PCR pode ser utilizado para determinar os aductos dos HAPs com uma sensibilidade de 1 aducto por 103 nucleótidos. Nesta técnica os aductos podem ser detectados na sua posição individual graças a várias enzimas usada na genética como a T4 endonuclease V ou a UvrABC nuclease e a técnicas químicas de clivagem que quebram o ADN na zona do aducto. Depois da clivagem ocorrem os ciclos de amplificação que permitem detectar o ADN que continha aductos de HAPs.
Determinação dos Metabolitos dos HAPs
A determinação dos metabolitos dos HAPs é feita frequentemente para avaliar a exposição a estes compostos. Esta determinação é feita na urina e o principal biomarcador utilizado é o 1-hidroxipireno (1-OHP) que é metabolizado a partir do Pireno pelo CYP1A1, e possivelmente pelo CYP1B1, e posteriormente é excretado na urina conjugado com glucoronideo . O 1-OHP é utilizado por ter como único precursor o Pireno (um HAP presente regularmente nas várias misturas de HAPs carcinogénicos que podem ser fontes de exposição), por representar 90% dos produtos de metabolismo do Pireno, por ter um tempo de semi-vida de 18-20 horas e por ser excretado pela urina.
O uso do 1-OHP como biomarcador está bem estudado e tem demonstrado ser capaz de relacionar os seus valores com o grau de exposição aos HAPs.
Os principais métodos usados para determinar o 1-OHP são:
- HPLC/FLD- Esta técnica é a mais utilizada para determinar o 1-OHP na urina e associa a separação dos compostos por HPLC com a detecção recorrendo a uma das propriedades do 1-OHP que é a sua elevada fluorescência. A técnica HPLC/FLD apresenta um limite de detecção de 0.05 mg/l, e uma taxa de recuperação de 85% .
- CG/EM- Técnica menos utilizada para determinar o 1-OHP. A separação do metabolito é feita com recurso à CG, apresentando o 1-OHP estabilidade térmica, seguido de detecção por EM. Esta técnica apresenta um limite de detecção de 0.1 mg/l, e uma taxa de recuperação de 93% .
Os metabolitos urinários do Fenantreno têm demonstrado nos últimos anos que podem também ser usados como biomarcadores da exposição aos HAPs. Embora pareçam ter menor capacidade para monitorizar a extensão da exposição parecem ser capazes de fornecer dados adicionais sobre a participação do citocromo P450 no metabolismo. A detecção destes compostos é feita por HPLC e o ideal seria optimizar um procedimento capaz de determinar conjuntamente o 1-OHP e os metabolitos do Fenatreno com a sensibilidade adequada.
Determinação dos aductos com Proteínas
Os aductos formados com as Proteínas só ocasionalmente são determinados pois a sua validade como biomarcador da exposição aos HAPs gera controvérsia. Apesar disso é possível detectar no sangue aductos dos HAPs com a albumina que tem um tempo de semi-vida de 20 dias e com a hemoglobina que tem um tempo de semi-vida de 120 dias.
Os aductos com proteínas presentes no sangue são medidos normalmente recorrendo-se a técnicas de CG/EM, HPLC, ou ELISA.
DETERMINAÇÃO NOS ALIMENTOS E EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
A detecção do Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs) em alimentos e em amostras ambientais como a água, o ar ou os solos pode ser usada com vários objectivos como a implementação dos limites legais ou a avaliação do risco de exposição aos HAPs. Actualmente a legislação, Europeia e Nacional, apresenta vários limites e valores alvo a ser respeitados. Para se atingir estas especificações é necessário que os métodos sejam bastante precisos devido aos baixos valores a detectar sendo que a própria legislação regula as características que os métodos devem apresentar.
Os estudos de avaliação de risco por sua vez necessitam de ser precisos e de ter uma gama de trabalho alargada.
Na determinação dos HAPs usam-se compostos indicadores da presença deste grupo. O Benzo[a]pireno é o mais utilizado mas as directivas oficiais que têm surgido aconselham que se determinem em simultâneo outros HAPs que possam também ser indicadores do grau de contaminação.
Os laboratórios que fazem as determinações devem dentro do possível estar acreditados para o efeito e devem tentar sempre melhorar a qualidade dos seus resultados. No caso de laboratórios que fazem determinações oficiais estas directrizes são obrigatórias e os laboratórios devem trabalhar em sintonias com laboratórios de referência na área que no caso dos alimentos na União Europeia é o "The Joint Research Centre of the European Commission” na Bélgica.
Embora a matriz sujeita a monitorização/detecção possa variar a sequência de etapas a que é sujeita a amostra é constante.
Figura 16 : Sequência das etapas na determinação dos HAPs
Preparação de Amostras
As amostras depois de colhidas têm de ser preparadas de forma a se poder determinar os HAPs. Em função do tipo de amostra presente é necessário utilizar procedimentos adequados para extrair os HAPs da matriz, eliminar os interferentes e se necessário ajustar à concentração adequada ao protocolo.
Os alimentos são provavelmente a matriz mais complexa na determinação dos HAPs, principalmente no caso da carne dos animais. Devido à lipofília de estes compostos eles difundem-se para o interior dos tecidos animais e para os extrair é necessário recorrer a uma hidrólise com solução metanólica de KOH. Após a saponificação a extracção dos HAPs é feita directamente por recurso a solventes orgânicos, à extracção Soxhlet ou a Sonicação. Após esta fase de extracção é normalmente necessário eliminar compostos interferentes como lipoproteínas que também foram extraídas. É usual recorrer-se a extracções líquido/líquido, com misturas de solventes polares e não polares, e a técnicas de adsorção cromatográfica com sílica-gel, alumina e “florisil”.
Nas amostras sólidas do tipo solo é comum recorrer-se à extracção Soxhlet, extracção com fluidos supercríticos e extracção líquida pressurizada. Para eliminar os interferentes recorre-se a técnicas de adsorção cromatográfica com sílica gel, alumina ou florisil .
Na determinação dos HAPs na água e no ar é usual determinarem-se outros compostos para além do benzo[a]pireno. As técnicas utilizadas na preparação das amostras são semelhantes às descritas embora tenham algumas especificidades. No caso do ar a recolha da amostra é feita com recurso a filtros e cartuxos absorventes. No caso da água é necessário proceder à concentração do analito. As técnicas utilizadas para esse efeito são a extracção líquido/líquido, a extracção em fase sólida (SPE) e a micro-extracção em fase sólida (SPME).
Separação Cromatográfica e Determinação
A separação cromatográfica é a fase da metodologia mais importante no que diz respeito à determinação do risco dos HAPs. Os HAPs são um grupo alargado de compostos em que nem todos apresentam risco para a saúde pública, portanto os métodos de separação deverão ser fornecer preferencialmente os teores daqueles que apresentam maior risco com maior exactidão e precisão.
Os métodos utilizados são:
• Cromatografia em Camada Fina: Primeiro método oficial presentemente em desuso.
• Cromatografia Gasosa (CG): Método bastante utilizado. Para a determinação de um largo número de HAPs requer colunas com alta eficiência. A detecção dos compostos separados por CG é feita normalmente por espectrometria de massa (EM) com sucesso sendo simplificado o processo se combinada com monitorização selectiva de iões. A detecção também pode ser feita por Detecção de Ionização em Chama ou Detecção por captura de Iões.
• Cromatografia Líquida e alta Pressão (HPLC): Método bastante utilizado. Inicialmente usava fases estacionárias com alumina ou sílica-gel, substituídas actualmente octadecilsilano e fetalimidopropilsilano. A detecção é feita normalmente por Detecção de Fluorescência ou em alternativa EM ou “diode array”.
Comparação entre HPLC e CG:
HPLC |
CG |
| Boa repetibilidade | Boa repetibilidade |
| Maior selectividade, maior poder de separação de isómeros | Maior eficência da coluna (vantagem em misturas complexas) |
| Consegue separar os e detectar os HAPs prioritários | Consegue separar os e detectar os HAPs prioritários |
| Tempos de retenção mais baixos | Tempos de retenção mais altos |
| Processo à temperatura ambiente sem correr risco de termo-decomposição | Processo à temperatura ambiente podendo ocorrer termo-decomposição |
| Bons resultados na gama 0,2µg-1000µg KG -1 | Bons resultados na gama 0,2µg-1000µg KG -1 |
Os dois métodos têm características distintas devendo ser utilizados em função do que se pretende com a determinação. Idealmente as determinações deviam ser efectuadas pelos dois métodos em simultâneo mas tal não se apresenta viável em análise de rotina.
Métodos Oficiais
A legislação não especifica os métodos que devem ser utilizados na determinação e monotorização dos HAPs, mas define os critérios de aceitação e sugere que os métodos a utilizar devem estar de acordo com os métodos padrão de instituições como a ISO (International Standard Organization) e ASTM International. De seguida apresentamos uma lista com uma série de métodos padronizados utilizados na detecção dos HAPs em amostras ambientais.[Dianne L. Poster et al]
Bibliografia
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