PROJECTO " Estudos farmacogenéticos para avaliação da influência do metabolismo na expressão da toxicidade de derivados anfetamínicos usados correntemente como drogas de abuso"

 

 

bulletEste projecto tem a referência POCI/SAU-FCF/57187/2004, sendo um Projecto aprovado pela FCT e pelo POCI 2010 e comparticipado pelo fundo comunitário FEDER.
bulletPeríodo do projecto: 01-6-2005 - 30-6-2008
bulletInvestigador Responsável: Prof. Doutora Maria de Lourdes Pinho de Almeida Souteiro Bastos
bulletInstituição proponente: Instituto de Ciências e Tecnologias Agrárias e Agro-Alimentares - Porto (ICETA-Porto/UP) 
bulletFinanciamento Concedido: € 65.001,00

 

Resumo do Projecto

   

Objectivos

  1. Esclarecimento dos factores envolvidos na variabilidade interindividual na susceptibilidade aos efeitos tóxicos de derivados anfetamínicos usados correntemente como drogas de abuso, nomeadamente das drogas 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, ecstasy) e 4-metiltioanfetamina (MTA, flatliners).
  2. Avaliação do envolvimento da expressão polimórfica da enzima do citocromo P450, CYP2D6, na toxicidade das anfetaminas em estudo, face à preponderância desta enzima na bioactivação metabólica destas drogas e à elevada variabilidade na actividade desta enzima dentro da população.
  3. Desenvolvimento de metodologias analíticas de forma a identificar e quantificar os metabolitos implicados na toxicidade das anfetaminas alvo do estudo.
  4. Avaliação do envolvimento de outros factores, incluindo outras enzimas metabólicas (catecol-o-metiltransferase, COMT) e interacções toxicológicas relevantes (co-ingestão de etanol), no aumento de susceptibilidade à toxicidade das anfetaminas alvo do estudo.

 

Tarefas

  1. Identificação e/ou quantificação dos metabolitos tóxicos envolvidos na expressão de toxicidade das anfetaminas usando o modelo das linhas celulares V79 (fibroblastos pulmonares de hamster chinês) geneticamente modificadas para a expressão da enzima metabólica polimórfica humana CYP2D6 (variantes CYP2D6*1, *2; *9; *10; *17) e da enzima CYP3A4
  2. Caracterização da toxicidade dos metabolitos identificados no modelo experimental e correlação com a actividade da enzima CYP2D6 e suas variantes polimórficas
  3. Avaliação da contribuição do metabolismo hepático humano para a variabilidade na susceptibilidade aos efeitos tóxicos das anfetaminas em estudo
  4. Identificação e quantificação dos metabolitos envolvidos nos efeitos tóxicos das anfetaminas alvo do estudo, provenientes da metabolização de fracções microssomais humanas. Estudo da contribuição de outras vias metabólicas para a toxicidade das anfetaminas em estudo
  5. Avaliação da correlação entre a capacidade metabólica individual para a enzima polimórfica CYP2D6 em fracções microssomais humanas e a extensão dos efeitos tóxicos das anfetaminas alvo do estudo. Estudo de outras interacções toxicológicas relevantes
  6. Tarefa Transversal: Divulgação dos resultados

 

Execução

 

Tarefa-1 - Identificação e/ou quantificação dos metabolitos tóxicos envolvidos na expressão de toxicidade das anfetaminas usando o modelo das linhas celulares V79 (fibroblastos pulmonares de hamster chinês) geneticamente modificadas para a expressão da enzima metabólica polimórfica humana CYP2D6 (variantes CYP2D6*1, *2; *9; *10; *17) e da enzima CYP3A4

 

Para cumprir o objectivo desta tarefa foi necessário desenvolver uma metodologia analítica que permitisse a identificação e quantificação dos metabolitos tóxicos envolvidos na expressão de toxicidade das anfetaminas. Deste modo, foi desenvolvido e validado um método de cromatografia líquida de alta resolução com detecção electroquímica por detector coloumétrico (HPLC-ECD) para a detecção e quantificação dos metabolitos catecólicos da MDMA, que pela sua elevada reactividade são de difícil caracterização analítica. Paralelamente, foram aplicadas metodologias previamente desenvolvidas pelo grupo de investigação para a caracterização analítica das drogas em estudo (4-MTA e MDMA) incluindo, cromatografia gasosa com detecção de massa (GC/MS) e HPLC com detecção de absorção no ultra-violeta com detector de fotodíodos (HPLC-DAD).

Uma vez desenvolvidas as necessárias metodologias, foram aplicadas a amostras obtidas de incubações das diferentes linhas celulares testadas com os compostos em estudo. As incubações foram realizadas em condições padronizadas de cultura celular. Deste modo, foi possível identificar e quantificar o metabolito de estrutura catecólica resultante da desmetilenação da MDMA, a N-metil-α-metildopamina (ou dihidroximetanfetamina; HHMA). A catalisação desta reacção metabólica por esta enzima é já bem conhecida e existem igualmente vários estudos que demonstram a toxicidade deste metabolito em diferentes modelos experimentais in vitro. A produção deste metabolito estava dramaticamente aumentada na linha celular que expressa a forma mais comum e de maior capacidade metabólica (variante *1; wild type) da CYP2D6. Consequentemente, foi levantada a hipótese de ser este o metabolito responsável pela maior expressão de toxicidade induzida pela MDMA nesta linha celular quando comparada à que ocorre quer nas linhas celulares controlo, quer nas linhas celulares que expressam as formas polimórficas e metabolicamente menos competentes (variantes *2; *9; *10 e *17). Esta hipótese foi subsequentemente testada na tarefa 2.

 

Calendarização: Tal como inicialmente previsto, a tarefa decorreu entre 1 de Junho de 2005 e 30 de Novembro de 2005, perfazendo o total de 6 meses.

 

Divulgação dos resultados: As metodologias desenvolvidas no âmbito desta tarefa do projecto foram igualmente aplicadas a material biológico humano, tendo em vista a sua possível aplicação clínica e/ou forense, e serão objecto de publicação, encontrando-se o manuscrito intitulado "Validation of a HPLC-ECD method for the quantification of the highly reactive metabolite of ecstasy, N-methyl-α-methyldopamine, in human serum" em fase de finalização para submissão a revista científica. Estes resultados foram divulgados através de:

 

bulletUm resumo publicado em revista internacional:
bullet Mergen G, Silva R, Ferreira LM, Branco PS, Remião F, Carvalho F, Bastos ML, Soylemezoglu, T. and Carmo H. (2006) Validation of a HPLC-ECD method for the quantification of the highly reactive metabolite of ecstasy, N-methyl-[alpha]-methyldopamine, in human serum. Toxicology Letters 164: S309. http://www.ff.up.pt/toxicologia/artigos/rel_farmac/resumo_mergen_2006.pdf

 

bulletUma comunicação na forma de poster em congresso internacional:
bulletMergen G, Silva R, Ferreira LM, Branco PS, Remião F, Carvalho F, Bastos ML, Soylemezoglu T and Carmo H. Validation of a HPLC-ECD method for the quantification of the highly reactive metabolite of ecstasy, N-methyl-[alpha]-methyldopamine, in human serum. 43rd Congress of the European Society of Toxicology (EUROTOX 2006), Dubrovnik, 2006.

 

 

Tarefa 2 - Caracterização da toxicidade dos metabolitos identificados no modelo experimental e correlação com a actividade da enzima CYP2D6 e suas variantes polimórficas

 

Na sequência dos resultados obtidos previamente foram conduzidas experiências com vista à avaliação da citotoxicidade das drogas em estudo, 4-MTA e MDMA, e do metabolito HHMA. Para este efeito foram realizados diferentes ensaios de avaliação de viabilidade celular através da quantificação da eficácia de formação de colónias celulares, tendo sido testadas diferentes concentrações de 4-MTA e MDMA. Para a avaliação da citotoxicidade do metabolito, os ensaios de viabilidade celular foram conduzidos numa linha celular V79 controlo exposta a diferentes concentrações de HHMA. As incubações foram realizadas em condições padronizadas de cultura celular. O tempo de exposição aos compostos foi de 24 horas, tendo sido testada uma gama de concentrações adequada à obtenção de um perfil de concentração-resposta.

Os resultados demonstraram que a linha celular que expressa a forma mais comum e com maior capacidade metabólica (variante *1; wild type) da CYP2D6 apresenta um aumento dramático na susceptibilidade à toxicidade induzida pela MDMA e 4-MTA quando comparada à que ocorre quer nas linhas celulares controlo, quer nas linhas celulares que expressam as formas polimórficas e metabolicamente menos competentes (variantes *2; *9; *10 e *17), quer na linha celular que expressa a CYP3A4. Tal como esperado, o metabolito induziu toxicidade para a linha celular testada. A HHMA demonstrou uma elevadíssima potenciação de toxicidade quando comparada ao composto seu percursor, a MDMA (superior a 100 vezes, nas condições testadas). Obteve-se o esperado perfil de concentração-resposta para o metabolito.

 

Calendarização: Tal como inicialmente previsto, a tarefa decorreu entre 1 de Dezembro de 2005 e 30 de Novembro de 2006, perfazendo o total de 12 meses.

 

Divulgação dos resultados: Estes resultados foram divulgados através de:

 

bulletDois artigos em revistas internacionais:
bullet Carmo H, Brulport M, Hermes M, Oesch F, Silva R, Ferreira LM, Branco PS, de Boer D, Remião F, Carvalho F, Schön MR, Krebsfaenger N, Doehmer J, Bastos ML, and Hengstler, J G. (2006) Influence of CYP2D6 polymorphism on 3,4-methylenedioxymethamphetamine (“Ecstasy”) cytotoxicity (2006) Pharmacogenetics and Genomics, 16: 789-799. http://www.ff.up.pt/toxicologia/artigos/rel_farmac/artigo_carmo_2006.pdf

 

bullet Carmo H, Brulport M, Hermes M, Oesch F, de Boer D, Remião F, Carvalho F, Schon M. R, Krebsfaenger N, Doehmer J, Bastos ML and Hengstler JG (2007) CYP2D6 increases toxicity to the designer drug 4-methylthioamphetamine (4-MTA). Toxicology 229(3): 236-244. http://www.ff.up.pt/toxicologia/artigos/rel_farmac/artigo_carmo_2007.pdf

 

bulletDois resumos publicados em revistas internacionais:
bullet Carmo H, Brulport M, Hermes M, Oesch F, Silva R, Ferreira LM, Branco PS, de Boer D, Remião F. and Carvalho F. (2006) Influence of CYP2D6 polymorphism on 3,4-methylenedioxymethamphetamine ("ecstasy") cytotoxicity. Toxicology Letters 164: S295-S296. http://www.ff.up.pt/toxicologia/artigos/rel_farmac/resumo_carmo_2006.pdf

 

bullet Carmo, H., Brulport, M., Hermes, M., Oesch, F., Boer, D. d., Remião, F., Carvalho, F., Schon, M. R., Krebsfaenger, N., Doehmer, J., Bastos, M. d. L. and Hengstler, J. G. (2007) Influence of CYP2D6 polymorphism on the cytotoxicity of the designer drug 4-methylthioamphetamine (4-MTA). Toxicology Letters 172, S40. http://www.ff.up.pt/toxicologia/artigos/rel_farmac/resumo_carmo_2007.pdf

 

bulletUm resumo publicado em revista nacional:
bullet Carmo H, Brulport M, Hermes M, Silva R, Ferreira LM, Branco PS, de Boer D, Remião F, Carvalho F, Krebsfaenger N, Doehmer J, Bastos ML and Hengstler JG. (2006) The influence of CYP2D6 polymorphic metabolism on the cytotoxicity of "ecstasy". Revista Portuguesa de Farmácia 52: 34.
bulletUma comunicação oral em congresso internacional:
bullet H Carmo, M Brulport, M Hermes, F Oesch, R Silva, LM, Ferreira, PS Branco, D Boer, F Remião, F Carvalho, MR Schon, N Krebsfaenger,J Doehmer, ML Bastos, JG Hengstler. Influence of CYP2D6 polymorphism on 3,4-methylenedioxymethamphetamine (‘Ecstasy’) cytotoxicity. International Symposium on Drugs of Abuse, Azores, 2008.
bulletDuas comunicações orais em congressos nacionais:
bullet Carmo H, Hengstler JG, de Boer D, Remião F, Carvalho FD and Bastos ML. Evaluation of the influence of polymorphic metabolism via Cyp2D6 on the cytotoxicity of ecstasy. XXXVI Reunião Anual da Sociedade Portuguesa de Farmacologia e XXIII Reunião da Farmacologia Clínica. Lisboa, Dezembro de 2005.
bullet Carmo H, Brulport M, Hermes M, Silva R, Ferreira LM, Branco PS, de Boer D, Remião F, Carvalho F, Krebsfaenger N, Doehmer J, Bastos ML and Hengstler JG. The influence of CYP2D6 polymorphic metabolism on the cytotoxicity of "ecstasy". 1º Encontro Nacional de Bromatologia, Hidrologia e Toxicologia. Sesimbra, 2006
bulletTrês comunicações na forma de poster em congressos internacionais
bulletCarmo H, Brulport M, Hermes M, Oesch F, Silva R, Ferreira LM, Branco PS, de Boer, D, Remião F, Carvalho F, Bastos, ML and Hengstler JG. Influence of CYP2D6 polymorphism on 3,4-methylenedioxymethamphetamine ("ecstasy") cytotoxicity. 43rd Congress of the European Society of Toxicology (EUROTOX 2006), Dubrovnik, 2006
bullet Carmo H, Brulport M, Hermes M, Oesch F, de Boer D, Remião F, Carvalho F, Schon MR, Krebsfaenger N, Doehmer J, Bastos ML and Hengstler JG. Influence of CYP2D6 polymorphism on the cytotoxicity of the designer drug 4-methylthioamphetamine (4-MTA). 44th Congress of European Society of Toxicology (EUROTOX 2007), Amesterdão, 2007
bullet Carmo H, Brulport M, Hermes M, Oesch F, Silva R, Ferreira LM, Branco PS, de Boer D, Remião F, Carvalho F, Schon MR, Krebsfaenger N, Doehmer J, Bastos ML and Hengstler JG. CYP2D6 metabolizing genotype as a risk factor for “ecstasy”-induced toxicity. III Mediterranean Academy of Forensic Sciences Congress; V Congreso Latinoamericano de Derecho Médico; III Congreso Ibérico de Medicina Legal. Porto, 2007
bulletUma comunicação na forma de poster em congresso nacional
bulletCarmo H, Hengstler JG, de Boer D, Remião F, Carvalho F and Bastos ML. The influence of CYP2D6 polymorphic metabolism on the cytotoxicity of ecstasy. IV Encontro do REQUIMTE, Fátima, 2006

 

 

Tarefa 3 - Avaliação da contribuição do metabolismo hepático humano para a variabilidade na susceptibilidade aos efeitos tóxicos das anfetaminas em estudo

 

Foram realizados ensaios com vista à caracterização da citotoxicidade da MDMA na presença e na ausência de homogeneizados de fígado humano. Para tal foram efectuados dois estudos de citotoxicidade com avaliação de viabilidade celular por dois métodos distintos, o ensaio de viabilidade com o corante MTT e o ensaio da eficácia de crescimento de colónias celulares. Nestes estudos, as células V79 (fibroblastos pulmonares de hamster chinês; desprovidas de actividade enzimática para o citocromo P450) foram incubadas com a MDMA, em diferentes concentrações e diferentes tempos de exposição, e a viabilidade celular foi avaliada no final do período de incubação pelos dois métodos. As células foram incubadas com um sistema gerador de NADPH, na presença e na ausência de homogeneizado de fígado humano para a avaliação da citotoxicidade. Os ensaios foram optimizados quanto ao tempo de exposição, concentração de MDMA, e quantidade de proteína de homogeneizado por incubação. Estas incubações foram realizadas em duplicado para a avaliação paralela, e sob as mesmas condições experimentais, da produção de metabolitos pelos diferentes homogeneizados de fígado humano, tal como previsto na 4ª Tarefa do presente projecto. Os resultados obtidos nos diferentes ensaios e com os diferentes homogeneizados de fígado humano, provenientes de diferentes dadores, revelaram uma ausência de capacidade de bioactivação metabólica por parte destes homogeneizados. Estes ensaios foram igualmente realizados com a droga de abuso 4-MTA, tendo sido obtidos os mesmos resultados de ausência de bioactivação metabólica e de citotoxicidade nas condições experimentais testadas.

Para testar a possibilidade da capacidade metabolizadora dos homogeneizados de fígado humano não ser suficiente para produzir a citotoxicidade anteriormente observada com as linhas celulares que expressavam a enzima principalmente responsável pela bioactivação destas drogas de abuso, foram testadas fracções microssomais obtidas de fígado humano. Os ensaios de citotoxicidade foram repetidos nas mesmas condições experimentais anteriormente testadas com os homogeneizados de fígado e uma vez mais pôde ser observada a ausência de bioactivação metabólica e consequente citotoxicidade. Perante os resultados obtidos foi concluído que o presente modelo experimental não é capaz de provar a bioactivação metabólica dos derivados anfetamínicos pelos homogeneizados de fígado e/ou fracções microssomais humanos. A explicação mais provável para a resistência à citotoxicidade observada prende-se com o curto tempo de incubação limitando a exposição às drogas testadas e consequentemente impedindo a observação de citotoxicidade. Com o objectivo de melhorar o presente modelo experimental, possibilitando o estudo proposto nestas tarefas, foram implementados ensaios experimentais que estão presentemente em curso e que recorrem ao uso de células neuronais serotonérgicas. O uso destas células apresenta a dupla vantagem de serem mais sensíveis aos efeitos de bioactivação dos compostos e de simultaneamente reflectir os alvos da toxicidade humana destas drogas. Para estudar os efeitos de citotoxicidade associados à bioactivação metabólica dos compostos estão a ser utilizadas fracções microssomais humanas provenientes de dadores previamente caracterizados para a actividade metabólica da CYP2D6 e de outras isoenzimas do citocromo P450. Como controlo positivo da capacidade de bioactivação metabólica, neste modelo experimental, estão a ser utilizados microssomas preparados de células de insecto infectadas com baculovirus recombinantes contendo a CYP2D6 humana e uma NADPH-P450 reductase de coelho (baculossomas). Os resultados obtidos até esta data permitem antecipar a capacidade de bioactivação metabólica destas drogas de abuso em humanos recorrendo ao presente modelo experimental, estando em curso a repetição dos ensaios, após o que se espera consolidar os resultados preliminares obtidos por forma a proceder à sua divulgação na forma de artigo científico.

 

Calendarização: Face à dificuldade de implementação do modelo experimental mais adequado à concretização dos objectivos desta tarefa, os estudos que se iniciaram a 1 de Dezembro de 2006 estão ainda em curso, prolongando-se para além do prazo de finalização do projecto.

 

Divulgação dos resultados: aquando da finalização dos estudos incluídos nesta tarefa do projecto, serão elaborados os respectivos manuscritos correspondentes às duas drogas de abuso em estudo, em cuja submissão a revista científica constará o financiamento atribuído pelo presente projecto.

 

 

Tarefa 4 - Identificação e quantificação dos metabolitos envolvidos nos efeitos tóxicos das anfetaminas alvo do estudo, provenientes da metabolização de fracções microssomais humanas. Estudo da contribuição de outras vias metabólicas para a toxicidade das anfetaminas em estudo

 

Na sequência dos estudos realizados durante a 3ª tarefa do presente projecto, estão em curso os respectivos estudos de identificação e quantificação dos metabolitos produzidos pelos homogeneizados de fígado e/ou fracções microssomais humanas, com vista à identificação dos metabolitos potencialmente envolvidos na expressão dos efeitos citotóxicos observados, à semelhança do que foi já concretizado para o modelo das células V79 durante as tarefas 1 e 2.

Paralelamente, e no âmbito dos objectivos do presente projecto que visa o esclarecimento dos factores envolvidos na variabilidade interindividual na susceptibilidade aos efeitos tóxicos destas drogas de abuso, foram desenvolvidos estudos para a avaliação do envolvimento da enzima metabólica catecol-o-metiltransferase (COMT) na toxicidade da MDMA. No âmbito destes estudos foi desenvolvida e validada uma nova metodologia para a caracterização analítica dos metabolitos potencialmente envolvidos nos efeitos adversos mediados pela bioactivação metabólica catalisada pela COMT.

À semelhança da CYP2D6, a COMT tem sido associada ao carácter idiossincrático das intoxicações com MDMA como resultado da sua expressão polimórfica em humanos. O efeito hiponatrémico da MDMA tem sido associado a uma desregulação na libertação da hormona antidiurética (arginina-vasopressina; AVP) e foi identificado como a causa de numerosas intoxicações fatais após a ingestão desta droga de abuso. A bioactivação metabólica da MDMA, catalizada pela COMT, desempenha um papel crucial na libertação de AVP in vivo e in vitro. Foram realizados estudos in vivo com vista à avaliação da capacidade de libertação de vasopressina pela MDMA no rato. Foram constituídos 2 grupos de animais de cada género aos quais foi administrada, por via intraperitoneal, MDMA na dose de 20 mg/kg ou veículo. Os animais foram submetidos a anestesia e foi recolhido sangue da veia cava inferior, em diferentes tempos de amostragem. O sangue obtido deste modo foi utilizado para a determinação dos níveis séricos de AVP, com recurso a um imunoensaio, e para a quantificação da MDMA e dos seus principais metabolitos com base nas metodologias analíticas desenvolvidas no âmbito do projecto. Para avaliar os efeitos tóxicos induzidos pela administração de MDMA, e ainda dentro de cada um destes grupos, foram realizados ensaios durante um período de 24 horas com colheita de sangue venoso e recolha de urina para a determinação dos níveis de AVP e do perfil metabólico, sendo igualmente avaliados o volume de água ingerido, volume de urina produzida, e o peso do cérebro, para verificar a possível existência de edema cerebral e caracterizar o efeito hiponatrémico.

Os resultados indicaram que a MDMA causa um aumento significativo nos níveis plasmáticos de vasopressina em animais macho e fêmea ao final de 1 hora após administração da droga. Estes resultados foram comprovados pela análise da hormona excretada na urina durante 24 horas, havendo uma correlação estatisticamente significativa entre os níveis excretados da droga e dos metabolitos produzidos pela COMT. Durante este período, a relação entre o volume de água ingerido e o volume de urina dos animais indica claramente um efeito de inibição de diurese nos animais tratados com MDMA.

 

Calendarização: Os trabalhos desta tarefa iniciaram-se, tal como previsto, em Abril de 2007 tendo-se prolongado até à data de finalização do presente projecto.

 

Divulgação dos resultados: A metodologia desenvolvida no âmbito desta tarefa será objecto de publicação, encontrando-se o manuscrito intitulado " Gas-Chromatography-Mass Spectrometry method for simultaneous measurement of MDMA (ecstasy) and its metabolites HMA, MDA and HMMA in plasma and urine " em fase de finalização para submissão a revista científica. Estes resultados foram divulgados através de:

 

bulletUm seminário de mestrado:
bullet Daniel Gomes Esteves da Silva: "Toxicocinética e Acção Toxicológica da MDMA (“Ecstasy”)". Orientador: Helena Maria Ferreira Carmo. Provas realizadas no dia 28 de Maio de 2008 na Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto.
bulletUma dissertação de mestrado:
bullet Daniel Gomes Esteves da Silva: "Estudo do envolvimento da bioactivação metabólica no efeito hiponatrémico da 3,4-metilenodioximetanfetamina (“Ecstasy”)". Orientador: Helena Maria Ferreira Carmo. Provas a realizar no dia 24 de Setembro de 2008 na Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto.
bulletUma comunicação oral em congresso nacional:
bullet Gomes D, Carmo H, Carvalho F, Remião F, Bastos ML, Branco P, Ferreira and Pinho, PG (2007). Gas-chromatography-mass spectrometry method for simultaneous measurement of MDMA (ecstasy) and its metabolites HMA, MDA and HMMA in plasma and urine. XXXVIII Reunião Anual da Sociedade Portuguesa de Farmacologia, XXIV Reunião de Farmacologia Clínica e VII Reunião de Toxicologia. Coimbra, Dezembro de 2007.
bulletUma comunicação na forma de poster em congresso internacional
bullet Carmo H, Gomes D, Carvalho F, Remião F, Bastos ML, Branco PS, Ferreira LM, Guedes de Pinho P. Optimized GC-MS/MS quantification of MDMA (ecstasy) and its metabolites HMA, MDA and HMMA in different matrices for toxicological applications. AOAC Europe Section International Workshop and the II Encontro Nacional de Bromatologia, Hidrologia e Toxicologia, Lisboa, Abril 2008
bulletUma comunicação na forma de poster em congresso nacional
bullet Gomes D, Carmo H, Carvalho F, Remião F, Branco P, Ferreira L, Bastos ML and Pinho PG. Gas-Chromatography-Mass Spectrometry method for simultaneous measurement of MDMA (ecstasy) and its metabolites HMA, MDA and HMMA in plasma and urine. 4th Annual Meeting of the Portuguese Proteonomics Network (Procura); 1st Meeting of the Portuguese National Mass Spectrometry Network (RNEM), Aveiro, 2007.

 

 

Tarefa 5 - Avaliação da correlação entre a capacidade metabólica individual para a enzima polimórfica CYP2D6 em fracções microssomais humanas e a extensão dos efeitos tóxicos das anfetaminas alvo do estudo. Estudo de outras interacções toxicológicas relevantes

 

Na sequência dos trabalhos realizados durante a 3ª tarefa do presente projecto estão ainda em curso as experiências que permitirão avaliar a correlação entre a capacidade metabólica para a CYP2D6, apresentada pelas fracções microssomais humanas e pelos baculossomas contendo a CYP2D6 humana, e a extensão dos efeitos citotóxicos da MDMA e da 4-MTA. Inicialmente, estava prevista nesta tarefa a realização de estudos de quantificação da actividade enzimática da CYP2D6. No entanto, face às dificuldades na implementação do modelo experimental adequado ao estudo previsto na tarefa 3, optou-se pela utilização de fracções microssomais de dadores humanos previamente caracterizados quanto à actividade para as diferentes enzimas do citocromo P450, incluindo a enzima alvo CYP2D6. Com a conclusão destes estudos espera-se deste modo esclarecer o papel da CYP2D6 na bioactivação das drogas em estudo, permitindo alargar simultaneamente esta avaliação às restantes isoenzimas do citocromo P450.

Paralelamente, e no âmbito dos objectivos do presente projecto, foram estudados outros factores possivelmente envolvidos na variabilidade interindividual na susceptibilidade aos efeitos tóxicos das anfetaminas, incluindo a interacção toxicológica resultante da co-ingestão de etanol e o efeito hipertérmico resultante da acção biológica da MDMA. Para este efeito, foram desenvolvidas metodologias analíticas e realizados ensaios in vivo e in vitro em ratinhos e hepatócitos primários de rato mantidos em cultura, respectivamente. As experiências visaram caracterizar os efeitos tóxicos decorrentes da exposição concomitante à MDMA e ao etanol em condições de normotermia e em condições que mimetizam o efeito hipertérmico da MDMA. Nos ensaios in vivo ficou demonstrada a exacerbação do efeito hipertérmico e da hepatotoxicidade da MDMA decorrente da administração de MDMA a ratinhos expostos ao etanol de forma crónica. Esta interacção toxicológica foi também demonstrada in vitro tendo sido explorado mecanisticamente o sinergismo observado aquando da co-exposição das células em cultura ao etanol e à MDMA e que é particularmente marcado em condições de hipertermia.

 

Calendarização: Os estudos desta tarefa iniciaram-se no prazo inicialmente previsto, a 1 de Agosto de 2007, tendo-se prolongado até à data de finalização do presente projecto.

 

Divulgação dos resultados: Os resultados dos estudos in vitro da interacção toxicológica entre a MDMA e o etanol serão objecto de publicação, encontrando-se o manuscrito intitulado " Synergistic toxicity of ethanol and MDMA towards primary cultured rat hepatocytes " submetido a revista científica e estando em fase de finalização o manuscrito intitulado “Metabolic interactions between ethanol and MDMA in primary cultured rat hepatocytes.”. Estes resultados foram divulgados através de:

 

bulletUm artigo em revista internacional:
bullet Pontes H, Duarte JA, Guedes de Pinho P, Soares ME, Fernandes E, Dinis-Oliveira R, Sousa C, Silva R, Carmo H, Casal S, Remião F, Carvalho F, Bastos ML. “Chronic exposure to ethanol exacerbates MDMA-induced hyperthermia and exposes liver to severe MDMA-induced toxicity in CD1 mice.” Toxicology, 2008 DOI: 10.1016/j.tox.2008.07.064. http://www.ff.up.pt/toxicologia/artigos/rel_farmac/artigo_pontes_2008.pdf

 

bulletUma comunicação oral em congresso internacional:
bullet  Pontes, H. Synergism of hepatotoxic effects between ethanol and ecstasy. International Symposium on Drugs of Abuse, Azores, 2008.
bulletDuas comunicações na forma de poster em congressos internacionais:
bulletPontes H, Fernandes E, Guedes de Pinho P, Carmo H, Remião F, Carvalho F, and Bastos ML, “Ethanol increases MDMA metabolism by primary rat hepatocytes cultures.” International Courses on Toxicology 2008 - “Metabolic Toxicology: From Pathway to Organism”, Coimbra, Abril 2008
bullet Pontes H, Guedes de Pinho P, Casal S, Carmo H, Santos A, Magalhães T, Remião F, Carvalho F, Bastos ML, “Determination of ethanol, methanol, acetone and acetaldehyde by a simple capillary direct injection gas chromatographic method in human whole blood, vitreous humour and urine and in cell culture medium.” AOAC Europe Section International Workshop and the II Encontro Nacional de Bromatologia, Hidrologia e Toxicologia, Lisboa, Abril 2008

 

Tarefa 6 - Validação dos resultados in vitro através do estudo de amostras provenientes de intoxicações fatais com anfetaminas

 

Esta tarefa, inicialmente prevista no projecto, não foi ainda realizada, uma vez que os estudos conduzidos com a s fracções microssomais humanas ainda estão em curso.

 

 

Resultados científicos versus objectivos

           

Os resultados podem ser analisados por uma perspectiva científica e por uma perspectiva de formação.

 

Resultados científicos versus objectivos

 

Face aos objectivos científicos inicialmente propostos pelo projecto os resultados obtidos dos estudos permitiram:

 

1- Demonstrar o envolvimento da expressão polimórfica da CYP2D6 na susceptibilidade aos efeitos citotóxicos das anfetaminas alvo do estudo nos modelos experimentais das células V79 geneticamente modificadas para a expressão das diferentes variantes polimórficas da enzima.

 

2- Resultados preliminares com fracções metabolizadoras humanas permitem confirmar os resultados anteriores, antecipando a importância deste polimorfismo genético em humanos. A confirmação destes resultados indicará que este polimorfismo pode estar na origem da elevada variabilidade interindividual observada em humanos no que respeita à susceptibilidade aos efeitos tóxicos destas drogas de abuso, explicando o carácter idiossincrático deste tipo de intoxicações.

 

3- Face às dificuldades sentidas na implementação do modelo experimental para os estudos de avaliação da importância do polimorfismo genético da CYP2D6 em humanos, foram paralelamente desenvolvidos estudos visando o esclarecimento de outros intervenientes importantes na variabilidade interindividual na susceptibilidade aos efeitos tóxicos das anfetaminas nomeadamente, o envolvimento da COMT na hiponatrémia induzida pela MDMA, e a avaliação da interacção toxicológica entre a MDMA e o etanol e do efeito da hipertermia nesta interacção. Estes estudos permitiram confirmar a natureza multifactorial do carácter idiossincrático das intoxicações com anfetaminas, em particular com a MDMA, bem como elucidar a importância das interacções toxicológicas entre diferentes drogas.

 

4- Desenvolver novas metodologias analíticas para suporte experimental dos estudos mas com possível aplicação clínica e/ou forense.

 

 

Resultados pedagógicos

 

O projecto teve como resultados de formação avançada:

 

bulletProvas de aptidão pedagógica e capacidade científica: Helena Maria Ferreira Carmo Vilaça. “Farmacogenética. A individualização da terapêutica em função da variabilidade interindividual da resposta farmacotoxicológica” e “Avaliação da influência do polimorfismo da enzima CYP2D6 na citotoxicidade da 4-metiltioanfetamina.” Provas realizadas nos dias 15 e 16 de Julho de 2005 na Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto.
bulletDissertação de doutoramento: Helena Maria Ferreira da Costa Ferreira Carmo. Estudo da Influência do Metabolismo na Toxicidade de Derivados Anfetamínicos: 4-MTA, 2C-B e MDMA. Provas realizadas no dia 14 de Fevereiro de 2007 na Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. Orientador: Professora Doutora Maria de Lourdes Pinho de Almeida Souteiro Bastos. Co-orientadores: Doutor Douwe de Boer e Professor Doutor Lesseps José António Lourenço dos Reys
bulletDissertação de mestrado: Daniel Gomes Esteves da Silva: "Estudo do envolvimento da bioactivação metabólica no efeito hiponatrémico da 3,4-metilenodioximetanfetamina (“Ecstasy”)". Orientador: Helena Maria Ferreira Carmo. Provas a realizar no dia 24 de Setembro de 2008 na Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto.

 

 

Divulgação dos resultados

 

Os resultados foram divulgados em publicações científicas e em comunicações em congressos científicos nacionais e internacionais. Alguns dos resultados obtidos durante este projecto serão ainda alvo de divulgação científica aquando da finalização dos estudos que ainda estão em curso. Adicionalmente, foi construída uma página web no site do Serviço de Toxicologia da Faculdade de Farmácia onde se divulga o projecto e os seus resultados: http://www.ff.up.pt/toxicologia/ (a página do projecto encontra-se no directório de investigação). Em todos os produtos resultantes do projecto foi mencionado a fonte do seu financiamento nos agradecimentos.

 

Resumidamente, os indicadores de realização física correspondentes aos resultados obtidos no projecto foram:

bulletArtigos publicados em revistas internacionais: 3
bulletArtigos submetidos para publicação em revistas internacionais: 1
bulletManuscritos em fase de finalização para submissão para publicação em revistas internacionais: 3
bulletResumos publicados em revistas internacionais: 3
bulletResumos publicados em revistas nacionais: 1
bulletComunicações orais em congressos internacionais: 2
bulletComunicações orais em congressos nacionais: 3
bulletComunicações na forma de poster em congressos internacionais: 7
bulletComunicações na forma de poster em congressos nacionais: 2
bulletTeses de doutoramento: 1
bulletTeses de mestrado: 1

 

Conclusão

Com a conclusão dos trabalhos efectuados à data da finalização do presente projecto foi possível atingir os objectivos propostos ao caracterizar a influência do polimorfismo genético da enzima CYP2D6 na acção tóxica de anfetaminas usadas como drogas de abuso. Os estudos que estão em curso ou em fase de finalização permitem antecipar a relevância deste fenómeno em humanos no que respeita à diferente susceptibilidade à ocorrência de toxicidade decorrente da ingestão destas drogas. Paralelamente, foram também explorados outros factores possivelmente envolvidos no carácter idiossincrático das intoxicações com anfetaminas. Foi, deste modo, investigado o papel da enzima COMT na acção toxicológica da MDMA, bem como a relevância da interacção toxicológica entre esta droga e o etanol, uma associação frequente entre os utilizadores recreativos da MDMA.

Em conclusão, os trabalhos efectuados e os resultados obtidos permitiram cumprir o principal objectivo científico do projecto, o esclarecimento dos factores envolvidos na variabilidade interindividual na susceptibilidade aos efeitos tóxicos de derivados anfetamínicos usados correntemente como drogas de abuso. Foram também desenvolvidas novas metodologias que, para além de suportar os estudos das diferentes tarefas, são passíveis de futura aplicação clínica e/ou forense. Finalmente, este projecto subsidiou as experiências conducentes à obtenção de um grau académico de Doutor e de um grau académico de Mestre, cumprindo-se também os objectivos do ponto de vista de formação avançada.